MATERIALS AND METHODS
Plant cultivation. To obtain fast and regular germination, the seeds were pretreated and surface sterilized with concentrated sulfuric acid. The times of treatment in H2SO4 were as follows, in minutes: A. senegal, 14; A. bivenosa, 20; A. albida, 30; Leucaena leucocephala, 30; A. linaroides, 30; A. pyrifolia. 30: A. seyal, 30; A. tuntida, 30; A. farnesiana, 45; A. holosericea, 60 - A. raddiana, 60; A. mearnsii, 120; A. nilotica var. ~eb-neb, 120; A. nilotica var. tomentosa, 120; A. sieberiana, 120.
After treatment, the seeds were washed with water until all traces of acid were removed. The seeds were germinated in sterile petri dishes of water agar and then transferred to tubes containing Jensen medium (11) or to polythene pouches containing sterilized soil. One drop of liquid Rhizobium culture, 10’ cells per ml, was used for inoculation of tubes, and I ml of culture per plant was used for inoculation of pouches. Tubes were placed in a greenhouse, and pouches were incubated outside.
Bacterial growth medium. Rhizobium was grown on yeast extract-mannitol medium (11).
Total nitrogen. Plant shoots dried for 2 days at 60 C were weighed and finely ground, and total nitrogen was determined by the Kjeldahl method.
Acetylene reduction activity. The acetylene reduction activity of nodulated roots was measured by gas chromatography according to usual procedures (5).
Rhizobium strains. We isolated a large collection of tropical Rhizobium strains from different Acacia species and L. Ieucocephala growing in Senegal. Strains fell into two classes: fast- and slow-growing strains. Fast-growing strains had a generation time of 8 to 4 h; slow-growing strains had a generation time of 8 to 12 h. A taxonomic and cross-inoculation study to be published elsewhere (in preparation) indicated that slow-growing strains belonged to the cowpea miscellany and that fast-growing strains were distinctly different from slow-growing ones. Four fast-growing (ORS 901, ORS 902. ORS 908, and ORS 911) and four slow-growing (OHS 801, ORS 802, ORS 80:3, and ORS 806) Rhizobium strains were selected for study. ORS 901 and ORS 902 had been isolated from nodules of A. senegal; ORS 903 and ORS 803, from A. bivenosa; ORS 911, from A. farnesiana; ORS 801, from A. holosericea; ORS 802, from A. siberiana; and ORS 806, from L. Ieucocephala. The slow-growing tropical cowpea strain CB 756 and the fast-growing Leucaena strain NGR 8 were obtained from Australia.
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MATERIAIS E MÉTODOS UTILIZADOS
Cultivo de plantas. A fim de obter germinação rápida e regular, as sementes foram pré-tratadas e esterilizadas em superfície com ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado. Os períodos de tratamento em H2SO4 foram, em minutos, os seguintes: Acácia senegal, 14; Acácia bivenosa, 20; Acácia albida, 30; Leucaena leucocephala, 30; Acácia linaroides, 30; Acácia pyrifolia. 30; Acácia seyal, 30; Acácia tuntida, 30; Acácia farnesiana, 45; Acácia holosericea, 60; Acácia raddiana, 60; Acácia mearnsii, 120; Acácia nilotica var. ~eb-neb, 120; Acácia nilotica var. tomentosa, 120; Acácia sieberiana, 120.
Após o tratamento, as sementes foram lavadas com água até que todos os resíduos de ácido sulfúrico fossem removidos. As sementes de estudo foram germinadas em placas esterilizadas de petri de água e ágar, sendo depois transferidas para tubos contendo cultura média de Jensen (11) ou para bolsas de polietileno contendo amostras esterilizadas de solo. Uma gota de cultura de rizóbio, 10 células por ml, foi usada para inocular os tubos, e 1 ml de cultura por planta foi usado para inocular as bolsas de polietileno. Os tubos foram alocados numa estufa, enquanto as bolsas foram incubadas fora.
Crescimento bacteriano médio. Rizóbio foi cultivado em meio extrato de levedura de manitol (11).
Nitrogênio total. Brotos de planta secos por dois dias e submetidos a 60ºC foram pesados e moídos, e a taxa total de nitrogênio foi determinada a partir do método de Kjeldahl.
Redução de atividade de acetileno. A redução da atividade do acetileno de raízes noduladas foi medida através de cromatografia gasosa de acordo com procedimentos padrão (5).
Cepas de rizóbio. Isolamos uma grande variedade de cepas tropicais de rizóbio de espécies distintas de acácia e L. Leucocephala crescendo no Senegal. As cepas se dividiram em dois tipos: rápido e lento crescimento. Cepas de crescimento rápido tiveram tempo de geração entre 8 e 4h; as [cepas] de crescimento lento tiveram tempo de geração entre 8 e 12h. Um estudo de taxonomia e inoculação cruzada a ser publicado em outra revista (em produção) revela que cepas de crescimento lento pertenciam a cultivares de feijão-caupi e as de rápido crescimento eram particularmente distintas das de crescimento lento. Quatro cepas de rizóbio de crescimento rápido (ORS 901, ORS 902, ORS 908, ORS 911) e quatro de crescimento lento (OHS 801, ORS 802, ORS 803, ORS 806) foram selecionadas para o estudo. ORS 901 e ORS 902 foram isoladas dos nódulos de raízes de Acácia senegal; ORS 903 e ORS 803 [isoladas de raízes] de Acácia bivenosa; ORS 911, [isoladas de raízes] de Acácia farnesiana; ORS 801, [isoladas de raízes] de Acácia holosericea; ORS 802, [isoladas de raízes] de Acácia sieberiana; e ORS 806, [isoladas de raízes] de L. leucocephala. A cepa de lento crescimento de feijão-caupi, CB 756, e a cepa de crescimento rápido de Leucaena, NGR 8, foram obtidas na Austrália.
